白血病是儿童时期最常见的恶性疾病，占15岁以下儿童恶性肿瘤的25%～30%，占20岁以下青少年恶性肿瘤的25%。白血病是血液系统恶性疾病。按白血病细胞的起源主要分为急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia,AML）、慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia,CML）和急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL），其中ALL占75%～80%,AML占15%～20%，其他类型白血病在儿童中发病率极低。近年急性淋巴细胞白血病治愈率不断上升，急性髓系白血病治愈率无明显变化，尤其难治复发型急性髓系白血病的治疗难度仍较大。世界卫生组织明确FLT-3/ITD阳性急性髓系白血病归为难治白血病、预后差类型，造血干细胞移植为此类型有效治愈手段，而预处理方案选择显得尤其关键。现将本中心2例FLT-3/ITD阳性难治白血病移植预处理采用克拉屈滨联合马法兰方案的安全性及疗效进行分析。

1 病例资料

病例1，患者女，16岁，主因“确诊白血病1个月余”为行异基因造血干细胞移植入院。患儿于2008年诊断再生障碍性贫血，口服司坦唑醇治疗8个月；2009年口服中药1年；2010年口服中药+间充质干细胞治疗1年；2011年予中药+司坦唑醇治疗2年余；2014年12月复查骨穿提示骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS)-RCMD。2015年12月经骨髓MICM分型确诊为AML-M5，骨髓形态：66%原始及幼稚单核细胞；免疫分型：异常细胞群约占有核细胞的79.60%，表达CD117、CD34、HLA-DR、CD33、CD13、CD123、MPO，弱表达CD38、CD64、CD9；不表达CD15、CD1 1 b、CD56、CD36、CD14、CD4、CD19、CD10、cCD79a、cCD3，符合AML表型；骨髓融合基因：FLT3-ITD（+）、WT1基因定量：356.98%;FISH探查：5q,7q,TP53,8号染色体未见异常；骨髓染色体：47,XX,+11/46,XX；遗传及免疫缺陷相关突变基因筛查可见FANCM突变基因：FANCMNM-02exon14c.A2330G；染色体断裂实验（-）。经骨髓MICM分型诊断：AML-M5(MDS转化，FLT3-ITD阳性）。患儿由MDS转为AML，且存在FLT3-ITD（+），提示高危。于2015年12月21日予Dec+CAG方案（地西他滨20mg/m²×5d+阿霉素25mg/m²×2d+阿糖胞苷1g/m²×3d+G-CSF）化疗，化疗后评估骨髓形态未缓解，MRD 51.52%。于2016年1月28日予IAE(IDA 10mg/m²×2d+AraC100mg/m²×7d+VP16 100mg/m²×5d）方案化疗，化疗后评估骨髓形态未缓解，MRD 33.02%。为长期生存，家长要求行造血干细胞移植，配型评估：父母均为HLA 5/10相合，父亲有一定重症急性GVHD风险，母亲较低；父亲有一定的GVL作用，母亲较弱。确定行父供女异基因造血干细胞移植（HLA配型5/10相合，KIR有效受体2DL1，血型0+供B+），行父供女单倍型造血干细胞移植术，预处理方案为：TBI 450cGyd-9～d-8，克拉屈滨5mg/m² d-9～d-5，阿糖胞苷2g/m² d-9～d-5，马法兰70mgd-3～d-2,ATG 5mg/m²d-4～d-1。患儿预处理过程顺利，以无关供者脐血细胞为第三方细胞，回输供者细胞MNC8.03×108/kg,CD34+T细胞5.92×106/kg。移植15d白细胞植活，12d后血小板植活。患儿目前移植后2.8年，骨髓持续缓解，生存状态良好，骨髓形态及免疫残留持续阴性，FLT3-ITD阴性，WT1阴性，供受者嵌合率100%。

病例2，女，2.9岁，患儿2015年9月以“低热伴皮肤淤斑”起病，就诊于天津，骨髓形态：增生极度活跃，单核细胞明显增多，以原、幼单核细胞为主（原单核细胞22.5%，幼单核细胞43.5%）；免疫分型：异常细胞约占有核细胞的61.4%,CD117、CD38、CD33、CD123表达，CD34、HLA-DR、CD7、CD9部分表达，CD13不表达；融合基因：NUP98-HOXD13(+),AML基因突变：FLT3/ITD（+）；骨髓染色体：46,XX,t(2;11)(q32;p15）。经骨髓MICM分型诊断：AML-M5(NUP98-HOXD13阳性，FLT3/ITD阳性）。予MAE(Mit8mg/m²×3d+AraC100mg/m²×7d+VP16 100mg/m²×3d）方案化疗后评估骨髓形态示幼单核细胞56%,MRD32.66%为恶性髓系幼稚细胞，FLT3-ITD(+),NUP98-HOXD13（+），染色体：46,XX,t(2;11)(q32;p15），提示骨髓未缓解。后予HAD(Har 2mg/m²×5d+AraC 2g/m²×3d+DRN8mg/m²×2d）方案化疗，化疗后评估骨髓形态示原单核细胞0.5%，幼单核细胞30%。入本院予AA(IDA10mg/m²×2d+AraC 3g/m²×2d）方案化疗后骨髓形态提示原幼单核细胞14%;MRD示8.06%急性髓系幼稚细胞；染色体：46,XX,t(2;11)(q31;p15）/46,X,t(X,12)(q22;q13),t(2;11)(q31;p15);NUP98-HOXD13定量17.81%;FLT3-ITD持续阳性。患儿3个疗程未缓解，属高危组。其父与患儿HLA配型为5/10相合，有效KIR受体为2DL3，血型A+供A+。行异基因造血干细胞移植，清髓性预处理方案为：克拉屈滨5mg/m²d-11～d-7+阿糖胞苷2g/m²d-11～d-7+伊达吡星10mg/m² d-9～d-7+白消安0.8mg/（kg·6h)d-6～d-4+马法兰70mg/m²d-3～d-2+ATG 5mg/kg d-4～d-1+环磷酰胺25mg/m²d+3～d+4。患儿预处理过程中出现肿瘤溶解综合征、肺部感染及药物性肺损伤，经治疗后好转。以无关供者脐血细胞为第三方细胞，回输供者细胞MNC 11.3×10⁸/kg,CD34⁺5.37×10⁶/kg。移植17d白细胞植活，44d后血小板植活。移植后骨髓MRD持续阴性，FLT3-ITD转阴，NUP98-HOXD13 0.54%，供受者嵌合率100%。现移植后1.7年，骨髓持续缓解，生存状态良好。

2 讨论

FMS样的酪氨酸激酶3(Fms-liketyrosinekinase3-internal tandem duplication,FLT3）属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶（receptortyrosinekinaseⅢ，RTKⅢ）家族成员。近年来，许多大样本研究已经证实FLT3激活突变在AML的发生及疾病的进展中起到十分重要的病理作用。研究发现FLT3有两种类型的激活突变：近膜结构域的内部串联重复（internal tandem duplication,ITD）和激酶结构域活化环的点突变（point mutation in the activation loop,TKD）。发生突变的FLT3受体能在配体非依赖的条件下发生受体的自动磷酸化和组成性激活，进而引起下游异常信号转导，影响正常造血系统的发育，产生抗凋亡和分化阻滞的致癌作用，在血液系统恶性疾病的发生、发展中具有重要的病理作用。ITD在AML和MDS患者中的发生率分别为15%～35%和5%～10%，在ALL中的发生率<1%，且主要见于双表型的ALL病例；TKD在AML、MDS和ALL患者中的发生率分别为5%～10%、2%～5%和1%～3%,FLT3/ITD在M3和M5中有较高的发生率，而在M6和M7中的发生率较低。FLT3的两种激活突变在核型正常患者中的发生率要高于异常核型的患者，但需要特别指出的是，FLT3/ITD在t(15;17）的AML患者中的比例较高，在具有t(15;17）染色体易位的M3患者中的发生率近50%，而在t(8;21）和inv(16）等核结合因子（core-binding factor）异位和低危组染色体核型的AML中比例较低。

具有FLT3/ITD激活突变的AML患者通常具有外周血白细胞计数高、临床预后差、易复发等独特的临床特征，且越来越受重视。2017年修订的急性髓系白血病欧洲白血病分类将患儿分为3个预后风险类别，并考虑其他因素，按FLT-3等位基因比例进行风险分层[1]，可见FLT-3对于评估AML预后有重要影响地位。有许多成人大样本AML资料显示，携带有FLT3/ITD突变的患者在诊断时白细胞计数显著高于无FLT3/ITD突变的患者，典型FLT3/ITD突变者白细胞计数比野生型FLT3者高2倍以上，在儿童AML样本中FLT3/ITD突变者白细胞增高的程度与成人类似。FLT3-ITD突变阳性在染色体正常核型AML患者中比例较高；FLT3-ITD突变的阳性组在外周血白细胞数量和骨髓原始细胞数量方面明显高于该突变阴性组患者[2]。有报道认为，FLT3-ITD(+)AML完全缓解，率28.57%，显著低于FLT3-ITD(-)AML的55.56%(P=0.03),FLT3-ITD+AML 2年无事件生存率为29.2%，低于FLT3-ITD-AML组的37.7%(P=0.04),FLT3-ITD+AML联合表达NPM1者占33.33%，明显高于FLT3-ITD-AML组的1.39%(P=0.001),FLT3-ITD+AML中表达NPM1的患者均未达完全缓解[3]。唐思诗等研究FLT3基因高表达组患者生存时间较低表达组短（P<0.05),Cox回归显示FLT3基因表达高水平患者死亡风险是FLT3基因表达低水平者的3.810倍（B=1.338，相对危险度3.810,95%CI:1.820～7.947,P<0.001），高表达组总生存率为56.63%，低表达组为70.45%，两组间差异有显著性（P<0.05)[4]。复发的AML患者FLT3/ITD的发生率高于初治AML患者，且84%具有FLT3/ITD突变的患者复发时仍然存在FLT3/ITD突变，初发时不具有此种突变的患者复发时仍有可能发生此突变。在一些患者中，如果FLT3/ITD出现在疾病的进展过程中，也就是说FLT3/ITD可能是白血病患者复发的一个预告因素；另外FLT3/ITD可能是白血病患者化疗耐药的一个重要机制，由于FLT3/ITD寡克隆具有选择性生长优势，能够耐受化疗药物的作用，使得肿瘤细胞对化疗药物产生耐受，进而容易复发。

由于FLT3激活突变的检测方法简单易行，越来越多研究者致力于将FLT3发展为AML患者常规检测手段用来指导AML患者的治疗、预后判断和微小残留白血病检测手段，并将其作为白血病患者化疗药物的又一新靶点。甲苯磺酸索拉非尼是一种新型多靶点抗肿瘤药物，可同时作用于肿瘤细胞和肿瘤血管。它具有双重抗肿瘤作用：既可通过阻断由RAF/MEK/ERK介导的细胞信号传导通路而直接抑制肿瘤细胞增殖，还可通过抑制血管内皮生长因子受体（VEGFR）和血小板衍生生长因子（PDGF）受体而阻断肿瘤新生血管形成，间接抑制肿瘤细胞生长。有研究发现索拉菲尼联合化疗的FLT3-ITD（+）患者中位生存时间有所延长（12个月，未口服者则为7个月）[5]。造血干细胞移植后患者服用索拉菲尼可受益，本研究中2例患儿移植后均服用索拉菲尼，获得持续缓解。近期一项新的研究结果认为硼替佐米、卡非佐米等蛋白酶体抑制剂可上调整应激调节蛋白REDD1，在FLT-3/TKD转化的细胞中比在FLT-3/ITD转化的细胞中更显著地诱导mTORCH1通路下调，而pi-1过表达在一定程度上阻止FLT-3/TKD通过内源性途径诱导FLT-3阳性AML的细胞凋亡，被认为是一种治疗AML很有前途的药物[6]。

克拉曲滨联合马法兰最开始用于治疗骨髓纤维化的患者。克拉屈滨是一种合成的2-脱氧核苷中间体，抑瘤活性与脱氧胞苷激酶和脱氧核苷酸激酶活性有关。它主要以被动转运进入细胞，在细胞内被脱氧胞苷激酶磷酸化，转化为克拉屈滨三磷酸，掺和到DNA分子中，妨碍DNA断裂后的修复作用，造成NAD和ATP的耗竭，破坏细胞代谢，影响细胞的DNA合成。因此本品对分化或静止期的淋巴细胞和单核细胞均有抑制DNA合成和修复的作用，可诱导细胞凋亡，且不被腺苷脱氨酶所灭活。克拉屈滨在细胞内浓度远高于血浆中，且可透过血脑屏障。

目前克拉屈滨作为一种挽救性治疗药物治疗难治及复发急性髓性白血病。Molteni等[7]将克拉屈滨用于难治复发急性髓性白血病患者经氟达拉滨为基础的挽救性化疗无效的移植前化疗，克拉屈滨组29%达到完全缓解，7%患者骨髓恶性细胞负荷明显下降至10%以下，此类患者进而获得异基因造血干细胞移植的机会，而其中21%获得较好结果者均为FLT3阳性。国内段明辉等使用CLAG方案治疗33例难治复发急性髓系白血病，其中5例为FLT-3/ITD阳性，经1个疗程化疗后78.8%获得完全缓解，其中5例FLT-3/ITD阳性患者全部缓解[8]。国内另一项研究使用含克拉屈滨方案治疗难治复发AML患者，8例中5例达完全缓解，1例部分缓解，2例无效[9]。一项以马利兰、马法兰、氟达拉滨和ATG的纯化疗预处理方案、以去除T细胞的外周血干细胞为预防物的研究表明：对于高危AML或MDS患者应用此方案的Ⅱ～Ⅳ度急性与慢性的GVHD累积发生率分别为8.8%和5.9%,5年总生存率与无病生存率分别为50.0%与46.1%，复发率与治疗相关死亡率分别为23.5%和28.4%，因此这一方案对于高危患者有利，且GVHD发生率和复发率更低[10]。

马法兰为沙可来新的左旋体，较消旋体沙可来新作用强。口服吸收良好，均匀分布体内各脏器，但不能透过血-脑脊液屏障。可用与多种肿瘤，在单一化疗及联合化疗中，为多发性骨髓瘤的首选药。多项研究认为马法兰联合氟达拉滨对于急性髓性白血病的治疗效果较好。Tsai等[11]认为，以氟达拉滨联合马法兰的减低剂量预处理异基因造血干细胞移植用于治疗老年急性髓性白血病或高危骨髓增生异常综合征，无病生存率、总生存率、无GVHD无复发率分别为38%、48%和32.1%。Kawamura等[12]比较了年龄>50岁的AML患者分别使用氟达拉滨+马利兰（6.4mg/kg)(FB2）、氟达拉滨+马利兰（12.8mg/kg)(FB4）、氟达拉滨+马法兰（140mg/m²)(FM140）的预处理方案，结果提示FB4、FM140两组复发率低于FB2组，对于高危AML和MDS者FM140组3年总生存率明显优于FB2及FB4组，因此认为虽然FM140组的非复发死亡率高，但其复发率明显下降仍更有意义，而对于高危的AML及MDS患者FM140的优势更明显。

马法兰用于治疗难治复发型白血病，有研究者从耐药机制方面对其进行研究，比较高三尖杉酯碱和马法兰的耐药机制，对天然来源抗肿瘤药物高三尖杉酯碱耐药株K562/H20与烷化剂马法兰耐药株K562/Mel耐药机制进行研究，发现前者对长春新碱、柔红霉素、阿霉素具有广泛交叉耐药，对马法兰耐药水平较低；后者对氮芥、噻替派有明显交叉耐药。在耐药机制上，前者主要由于多药耐药基因过度表达所致，谷胱甘肽-S-转移酶（GST）π、α基因也参与部分耐药机制；后者主要由于GSTα基因及GST总活性所致。两者似乎均通过GSTα基因表达升高起作用[13]。由此可见，急性髓系白血病化疗方案中常用药物为柔红霉素、阿霉素等，如白血病细胞对此些药物耐药可换用马法兰，可能耐药水平较低从而可能达到缓解。

2 例患儿在预处理方案止均以CLAG+ATG方案为基础，2例患儿因化疗过程中曾分别使用过去甲氧柔红霉素、米托蒽醌均未能缓解，故预处理过程中选用两例患儿未曾使用过的化疗药物，分别选用米托蒽醌、去甲氧柔红霉素分别组成CLAG-M与CLAG-I方案。本中心原则上对于多次化疗未能缓解患儿，如能配合使用TBI者优先使用，一方面可减少耐药可能，一方面减少药物副作用。本例中例1患儿年龄较大，可配合TBI体位要求，而例2患儿年龄略小，不能配合TBI所要求的体位，仍使用经典的BUCY方案。经如此处理，两例患儿均达到清髓、清肿瘤目的，骨髓完全缓解，完全供者型植入。对于有多次化疗史患儿，尤其难治复发者，可总结化疗过程，推测可能有效的化疗药物组合到预处理方案中，形成个体化预处理方案进行治疗。

以上结果可知，克拉曲滨对于氟达拉滨无效的难治复发急性髓性白血病仍有效，马法兰在清髓清肿瘤方面可优于马利兰。Styczynski等[14]在体外药物耐药方面研究发现，儿童髓系白血病复发组耐药率较初发组差异并无显著性，尤其髓系白血病细胞对于马法兰、塞替哌、异环磷酰胺和克拉屈滨敏感性更高。故我中心选择在BuCy+FLAG-I+ATG预处理方案基础上，采用BuCy+CLAG-I+Mel+ATG用于治疗难治复发急性髓性白血病（FLT-3阳性），效果较好。2例FLT-3阳性患者均在多次化疗未缓解情况下，经此预处理方案后达到完全缓解，预处理过程基本耐受，尤以年长儿耐受性更好，低幼儿耐受性略差，但均可完成预处理方案。患儿均采用亲缘单倍型造血干细胞移植，移植后骨髓持续缓解。

此预处理方案有清髓清肿瘤作用，对于肿瘤负荷大，或移植后复发率高者，可采用此方案。而由于此方案药物种类多、累积剂量较大，对于胃肠道相对发育不完全成熟的低幼儿（年龄<2岁者）可能耐受性差，可能会出现较严重的肠道反应。对于难治疗复发的大龄患儿可选用此预处理方案，故此方案值得扩大样本量继续研究。

甲苯碘酸索拉菲尼是一种新型多靶点抗肿瘤药物，可同时作用于肿瘤细胞的肿瘤血管，它具有双重的抗肿瘤作用：一是可通过中Ras/MEK/ERK介导的细胞信号传导通路而发酵乳抑制肿瘤细胞的增殖，还可通过抑制VEGF和血小板衍生生长因子（PDGF）受体而阻断肿瘤新生血管的形成，间接的抑制肿瘤细胞的生长。而索拉菲尼通过抑制FLT3-ITD突变、c-kit突变的AML细胞中ERK的激活，造成细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长[15]，从而明显提高难治、复发FLT3阳性患者的缓解率。本研究根据2例患儿移植预处理方案，在后期对于FLT-3阳性患儿均加用索拉菲尼联合治疗，结果可说明克拉屈滨联合马法兰的移植预处理方案可用于难治复发FLT-3+的AML患者，加用索拉菲尼可能将更获益。

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